Obsah
- Denaturace DNA
- Renaturace DNA
- Denaturace DNA teplem | Tepelná denaturace DNA
- Denaturace DNA úpravou NaOH
- Denaturace DNA prostřednictvím soli
- Který krok PCR způsobuje denaturaci dvouvláknové DNA
- Účinek močoviny na denaturaci DNA
- Závěry
- Rozhovor Otázky a odpovědi
Co je to Denaturace DNA
Během replikace DNA a další odlišný jev, ve kterém je pozorována aktivní účast DNA s oddělením vláken dvojité šroubovice DNA.
Vlákna dvojité šroubovice DNA lze oddělit jednoduše zahřátím rozpuštěné DNA při vysokých teplotách. Stojany DNA se oddělují kvůli narušení vodíkových vazeb, které drží pohromadě komplementární dusíkaté báze přítomné na opačných vláknech. Tento jev je známý jako tání DNA.
Rozsah tavení je určen teplotou tání (Tm), která je charakterizována jako teplota, při které se ztrácí téměř 50% dvojité šroubovicové struktury.
Vlákna dvojité šroubovice DNA lze také oddělit přidáním alkálie nebo kyseliny, vodíkové vazby jsou narušeny ionizací.
Dvojitá šroubovicová DNA absorbuje méně ultrafialového světla ve srovnání s jedním vláknem DNA kvůli skládání párů bází. Když DNA taje, procento jednovláknové DNA se zvyšuje, což vede ke zvýšení absorpčního profilu UV. Tento jev je známý jako hyperchromicita. Rozsah denaturace nebo tání lze tedy sledovat měřením absorbance při 260 nm.
Renaturace DNA
Segregovaná vlákna DNA začnou žíhat okamžitě, když teplota klesne pod Tm hodnota. Tento cyklus žíhání se často nazývá renaturace. Vlastnost denaturace a renaturace je velmi důležitá pro optimální biologické fungování DNA.
V buněčném prostředí jsou řetězce DNA odděleny působením enzymů, jako je helikáza a topoizomeráza na úkor energie (ATP), nikoli působením tepla nebo extrémního pH.
Schopnost DNA reverzibilně denaturovat a reanneal svědčí o genové expresi a o poloze a struktuře genu.
Řekněme například, pokud částice DNA ze dvou odlišných živých organismů denaturují a dovolí se navzájem znovu ožít nebo hybridizovat. Vlákna budou tvořit hybridy DNA, pokud jsou sekvence navzájem podobné. Rozsah hybridizace udává míru podobnosti mezi DNA dvou organismů.
Podobná pozorování lze provést s DNA a RNA uvnitř buňky k lokalizaci genů.
Tepelná denaturace DNA
DNA může být denaturována teplem a tento proces je stejný jako tání. Vzorek se zahřívá, dokud se nerozvinou DNA a neoddělí se dvě vlákna. Když jsou vlákna oddělena, DNA pak v tom okamžiku nechá dosáhnout stabilní teploty. Tento proces umožňuje tvarování vláken ve šroubovici DNA, která pak v tomto bodě vytváří komplementární párování, která lze brát jako markery.
Tepelná denaturace se každou chvíli používá při hledání rozdílu mezi různými druhy. Denaturace nebo tání DNA je však skutečně jednoduchý a přímý proces, nepoužívá se tam, kde je požadována přesnost. Tepelná denaturace DNA je považována za méně přesnou než sekvenování DNA a používá se pro mnohem širší aplikace. Tento druh denaturace může být rovněž použit uvnitř reakce polymerázového řetězce.
Denaturace DNA úpravou NaOH
Kromě zahřívání vzorku DNA lze k dosažení denaturace DNA použít také chemikálie, jako je NaOH. K denaturaci DNA lze použít specifickou koncentraci NaOH. Jak se množství použitého NaOH snižuje, denaturace bude trvat déle, než se očekávalo - přesto může být DNA v každém případě zcela denaturována. NaOH byl prokázán jako možná nejlepší a nejúčinnější strategie pro úplnou denaturaci DNA.
Různá chemická činidla, například formamid, nemohou denaturovat DNA tak rychle. Vzhledem k tomu, že NaOH lze použít v různých koncentracích, je také snadné jej bez problémů monitorovat. Navíc DNA, která je denaturována NaOH, může být renaturována pomocí pufrovacího roztoku fosfátů. DNA, která je denaturována různými chemickými činidly, jako je DMSO (dimethylsulfoxid), nelze tímto způsobem zcela renaturovat - a to může vést k použití NaOH pro další aplikace.
Denaturace DNA prostřednictvím soli
Velké množství soli v médiu způsobí, že DNA bude normálně denaturována při správném poměru soli. Denaturace DNA pomocí soli je jako denaturace pomocí organických rozpouštědel. obecně denaturaci DNA pomocí soli nelze renaturovat. Sůl se často používá místo kyseliny k úplné denaturaci DNA a může být také použita společně s teplem. Sůl se obecně nepoužívá jako jediné činidlo pro denaturaci - obvykle se používá s některými různými chemickými sloučeninami, jako je isopropanol a ethanol.
Tento proces může být použit pro denaturaci větších objemů DNA, což jej činí méně užitečným pro explicitní práci, nicméně cennější pro zvýšení a zpracování DNA ve větším množství.
Existuje však řada postupů spojených s denaturací DNA, konečný produkt je něco podobného: spojení mezi vlákny se přeruší a vytvoří se jednovláknová DNA, kterou lze určit několika způsoby. Nejlepší metoda denaturace DNA závisí na tom, k čemu by měla být DNA použita, jak přesné a explicitní by měly být korelace a objem materiálu, který musí být zpracován.
Zpravidla lze tepelnou i denaturaci solí snadno škálovat a použít ve větším množství, zatímco denaturace NaOH může být okrajově přesnější a cennější pro malá množství DNA.
Který krok PCR způsobuje denaturaci dvouvláknové DNA
Separace řetězců DNA probíhá v denaturačním kroku polymerázová řetězová reakce (PCR) který je popsán v následujících krocích:
Účinek močoviny na denaturaci DNA
Stejně jako tepelná a pH indukovaná denaturace DNA má i močovina schopnost denaturovat DNA. Močovina ve velkém množství řeší problémový stav struktur nukleových kyselin. Protože je močovina dárcem i příjemcem vodíkových vazeb, může nepochybně denaturovat nukleové kyseliny. 6–8 M močovina je skutečně kritickou složkou pro denaturaci polyakrylamidové gelové elektroforézy (dPAGE) široce používané k separaci DNA oligonukleotidů na základě velikosti. V této strategii jsou dvojité šroubovice DNA zcela denaturovány a cestují v polyakrylamidovém/agroseovém gelu jako lineární polymery.
K našemu neuvěřitelnému úžasu jsme přešli na částici DNA, která může tvarovat skládanou strukturu v 7 M močovině (7MU), která zůstává stabilní během cyklu 7MU-dPAGE. Důvodem je skutečnost, že tato DNA měla velmi vysokou koncentraci guaninového nukleotidu a vytvořila čtyřnásobné struktury.
Závěry
V tomto článku jsme diskutovali o denaturaci DNA, která je v oblasti molekulární biologie velmi často využívána jako účinný nástroj pro změnu, manipulaci a tvorbu rekombinantní DNA. Diskutovali jsme o denaturaci ve světle různých denaturačních látek, o kterých je známo, že narušují stabilizační síly Struktura DNA.
Rozhovor Otázky a odpovědi
Q1 Proč je DNA denaturována?
Odpověď: Jak víme, stabilita DNA je důležitá pro správnou funkci každé živé buňky. Existují však určité příležitosti, kdy denaturace DNA prospěje buňce při provádění běžných životních procesů. DNA denaturuje za vzniku dvou polynukleotidových vláken, provádí se pomocí specifických enzymů, jako je gyráza, topoizomeráza a helikáza, a denaturace je často lokalizována.
Důležité buněčné procesy, jako je replikace a transkripce DNA, vyžadují separaci DNA. zatímco denaturační fenomén se často používá, jsou pokročilé techniky molekulární biologie, jako je polymerázová řetězová reakce, otisky prstů DNA atd.
Q2 Co způsobuje denaturaci?
Odpověď: Vlákna DNA jsou držena pohromadě nekovalentními interakcemi, jako je vodíková vazba. Přerušení těchto vodíkových vazeb způsobuje oddělení řetězců DNA, které je známé jako denaturace DNA. Vodíkové vazby přítomné mezi nukleotidy DNA lze přerušit několika způsoby.
- Denaturace DNA teplem: Tepelná denaturace DNA
- Denaturace DNA extrémním pH: Denaturace DNA indukovaná pH
- Denaturace DNA solemi: Fyziologický roztok indukuje denaturaci DNA
Q3 Faktory ovlivňující denaturaci DNA
Odpověď: Denaturace DNA závisí na následujících faktorech
- Teplota: DNA každého organismu má pevnou teplotu tání/denaturace
- pH: DNA denaturuje při extrémním pH
- Osmolarita a slanost: Extrémní koncentrace soli také indukuje denaturaci DNA
- Obsah guaninu a cytosinu: Čím vyšší je obsah GC v DNA, tím vyšší bude teplota tání
- Obsah adenin-thyminu: Čím vyšší je AT v DNA, tím nižší bude teplota tání
Q4 Denaturační teplota DNA
Odpověď: Když se roztok DNA zahřeje nad 90oC, nárůst kinetické energie stačí k narušení nekovalentních vodíkových vazeb přítomných mezi dvěma vlákny DNA. Tyto nekovalentní interakce jsou zodpovědné za stabilizaci DNA. Narušení těchto sil vede k denaturaci DNA. Teplota tání DNA každého organismu je obecně nad 90oC.
Q5 Při jaké teplotě probíhá denaturace dvojité šroubovice DNA?
Odpověď: Obecně je teplota tání nebo denaturace DNA organismu blízká nebo vyšší než 90oC.
Q6 Jak pomáhá denaturace DNA analyzovat její struktury?
Odpověď: Když začne denaturace DNA, absorpce ultrafialového záření při 260 nm se postupně zvyšuje a dosahuje maxima, dokud nejsou dvě vlákna DNA zcela oddělena. Změna absorpce ultrafialového záření poskytuje představu o stupni denaturace a renaturace.
Otázka 7 Proč není denaturovaná DNA zničena?
Odpověď: K denaturaci DNA dochází v důsledku rozbití nekovalentních interakcí, takže je pouze denaturována, nikoli zničena. Polynukleotidová vlákna jsou tvořena kostrou fosfátu a kostra je tvořena kovalentními vazbami (vazbami), které se během denaturačního procesu nerozlomí.
Q8 Je denaturace DNA reverzibilní?
Odpověď: Ano, proces denaturace DNA je reverzibilní. Když se teplota sníží, oddělené řetězce DNA se začnou znovu spojovat tvorba vodíkových vazeb mezi komplementární sekvencí DNA. Opětovné spojení DNA podporuje obnovu dvoušroubovicové struktury DNA, a proto je denaturace DNA reverzibilní proces.
Q9 Proč je snazší denaturovat DNA než proteiny?
Odpověď: DNA i proteiny mohou být denaturovány použitím denaturačních látek, jako je teplo, extrémní pH, vysoká koncentrace solí a přítomnost dalších chemických denaturujících látek. Denaturace DNA je snadno pochopitelná, zatímco denaturace proteinů je složitý jev, protože struktura proteinů je stabilizována kovalentními i nekovalentními interakcemi. Některé proteiny mohou denaturovat velmi snadno, zatímco některé proteiny denaturují za velmi extrémních podmínek.
Q10 Pokud DNA není protein, proč říkáme, že DNA by mohla být denaturována?
Odpověď: O biomakromolekule se říká, že je denaturována, když začne ztrácet strukturální integritu nebo když změní strukturu. Protože DNA má také dobře definovanou strukturu, můžeme tedy při změně struktury DNA říci, že DNA je denaturována.
Otázka 11 Proč se při elektroforéze používají ovládací prvky?
Odpověď: Když provádíme elektroforézu DNA, často se používají kontroly (pozitivní a negativní). Pomocí kontroly kontrolujeme stav struktury DNA vzorku (ať už je dvouvláknová, jednovláknová, částečně dvouvláknová, vroubkovaná atd.). Dvouvláknová DNA běží v agarózovém gelu rychleji ve srovnání s jednovláknovou DNA, zatímco vroubkovaná DNA běží nejpomaleji.
Q12 Co se stane, když je DNA poškozena?
Odpověď: Poškozená nebo poškrábaná DNA běží nejpomaleji, zaostává a má nízkou mobilitu. Takto poničená nebo poškozená DNA pokrývá krátké vzdálenosti v elektroforéze na agarózovém gelu.
Q13 Které vazby se rozpadnou jako první, když dojde k denaturaci proteinů?
Odpověď: Vodíkové vazby spolu s dalšími nekovalentními interakcemi (hydrofobní síly, síly vander waal) jsou nejprve narušeny, zatímco kovalentní interakce, jako jsou disulfidické vazby, jsou během denaturačního procesu přerušeny jako poslední.
Q14 Jak se DNA přenáší z tepelně usmrceného kmene S na hrubý kmen R s ohledem na skutečnost, že DNA může projít denaturací?
Odpověď: Během tepelného zabíjení virulentní kmene S Pnuemococcus se jeho DNA denaturuje, ale když je smíchána s kmenem R, teplota není tak vysoká. DNA by se tedy během procesu míchání mohla znovu oživit a obnovit její funkčnost.
Q15 Může denaturace proteinů znamenat jejich rozdělení na fundamentálnější, ale funkční detekovatelné části?
Odpověď: Ne, denaturace je zaměřena pouze na změnu struktury biomakromolekul. Změna struktury přináší změnu nebo ztrátu funkce těchto molekul. Denaturace neznamená zničení nebo vloupání do základních jednotek. Denaturace není trávení.
Q16 Jaký je rozdíl mezi tepelně stabilní DNA polymerázou a normální DNA polymerázou?
Odpověď: Tepelně stabilní DNA polymeráza se získává z extremofilní bakterie Thermus aquaticus, liší se od normální DNA polymerázy, protože dokáže provádět replikaci DNA i při teplotě nad 90 °CoC.
Q17 Proč denaturace delších šroubovic DNA vykazuje větší kooperativitu než denaturace krátkých vláken?
Odpověď: Protože větší řetězce DNA mají v sobě více nukleotidů, existuje větší šance na vytvoření komplementárních párů bází, existuje větší šance na vytvoření velkého počtu vodíkových vazeb. Proto větší fragmenty DNA vykazují větší kooperativitu.
Otázka 18 Proč NaOH denaturuje DNA?
Odpověď: Zavedení NaOH zvyšuje pH média a činí jej zásaditým, OH ionty uvolněné z NaOH interagují s Guaninem a Thyminem a podporují lámání vodíkových vazeb, což nakonec vede k denaturaci DNA.
Otázka 19 Může denaturalizace DNA způsobená formaldehydem ovlivnit otisky prstů DNA?
Odpověď: Ne, formaldehyd neovlivní výsledek otisku prstu DNA. Protože otisky prstů DNA vyžadují restrikční štěpení a restrikční enzymy rozpoznávají specifické sekvence ve dvouvláknové DNA. Formaldehyd může denaturovat DNA, ale po odstranění formaldehydu (protože se používá pouze v procesu fixace po elektroforéze) se DNA vrátí zpět do své původní konformace, takže otisky prstů DNA nejsou ovlivněny.
Q20 Existuje nějaký nástroj, který by odlišoval denaturovanou DNA od normální DNA, kromě gelové elektroforézy?
Odpověď: Ano, existuje několik nástrojů a nástrojů, které fungují na principu spektroskopie pro stanovení teploty tání, a od toho můžeme rozlišovat denaturovanou a normální DNA. Další technikou je elektroforéza vzorků DNA na agarózovém gelu.
Q21 Jaký je účinek na denaturaci DNA, pokud je hodnota Tm zvýšena vztah mezi hodnotou Tm a denaturací DNA?
Odpověď: Vyšší hodnota Tm naznačuje, že struktura DNA má větší stabilitu ve srovnání s DNA s nižší hodnotou Tm.
Také čtení:
Jsem Abdullah Arsalan, dokončil jsem doktorát z biotechnologie. Mám 7 let zkušeností s výzkumem. Dosud jsem publikoval 6 článků v časopisech mezinárodní pověsti s průměrným impakt faktorem 4.5 a několik dalších je v úvahu. Prezentoval jsem výzkumné práce na různých národních a mezinárodních konferencích. Mým předmětem zájmu je biotechnologie a biochemie se zvláštním důrazem na proteinovou chemii, enzymologii, imunologii, biofyzikální techniky a molekulární biologii.