Mechanismus reverzní transkriptázy: 9 důležitých faktů

by

Obsah

Přepis

Přepis je začátkem „genového výrazu“.

V tomto procesu se informace obsažené v „čtyřpísmenném genetickém kódu DNA“ přenášejí do třípísmenného genetického kódu RNA. “

, můžeme vysvětlit transkripci, protože vytváří kopii RNA z DNA nebo se genetická informace přenáší z DNA do RNA.

Proces transkripce zahrnuje enzym známý jako RNA polymeráza; tento enzym používá DNA jako templát a usnadňuje spojení nukleotidů za vzniku RNA (odpovídající a komplementární k sekvenci templátové DNA).

Proces přepisu je dokončen ve třech fázích.

Fáze 1: Zahájení

Fáze 2: Prodloužení

Fáze 3: Ukončení

Eukaryotická transkripcejpg
Obrázek: Tři základní kroky transkripce (proces přenosu genetické informace z DNA do RNA); Zahájení, prodloužení a ukončení https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Eukaryotic_Transcription.png

U eukaryot je několik fází známých jako posttranslační modifikace, ve kterých RNA prochází modifikacemi, jako například:

Sestřih

5'-capping

Začlenění ocasu Poly A

Důležité upozornění: K transkripci dochází pro každý jednotlivý gen přítomný v našem genomu samostatně.

DNA má obrovské geny, každý gen kóduje gen. Transkripce kopíruje informace genu kódujícího protein do transkriptu RNA.

Transkriptáza

Transkriptázy jsou enzymy, které katalyzují syntézu RNA z templátové DNA; tento proces je znám jako transkripce. Reverzní transkriptázy (RT) jsou enzymy, které katalyzují tvorbu cDNA (komplementární DNA) z templátu RNA; tento proces je znám jako reverzní transkripce.

Reverzní transkripce

V procesu reverzní transkripce, DNA je syntetizována z templátu RNA (opak transkripčního procesu, při kterém je RNA syntetizována z templátu DNA). DNA produkovaná reverzní transkripcí je známá jako komplementární DNA (cDNA). Reverzní transkripce je prováděna enzymem známým jako reverzní transkriptáza. 

Požadavky na reverzní transkriptázu:

           Šablona RNA

           Krátký primer (pro vazbu s 3 'koncem RNA)

Krátký primer se váže na komplementární oblast na 3 'konci a zahajuje syntézu komplementární DNA. Tato cDNA se používá v PCR (polymerázová řetězová reakce) jako templátová DNA. cDNA se poté přeměňuje působením DNA polymerázy a DNA ligázy na dvouvláknovou DNA. Tato kombinace PCR a RT-PCR (kombinace polymerázové řetězové reakce a reverzní transkripce) umožňuje detekovat nepatrná množství RNA přítomných ve vzorku. Reverzní transkripce se často používá při klonování ke zvýšení počtu kopií. 

Reverzní přepis
Obrázek: Schéma reverzní transkripce, RT se váže na ssRNA a řídí syntézu cDNA, která se později převede na dsDNA. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.jpg

Ke zvýšení efektivity tvorby produktu se často používá několik upravených RT. Inženýrská RT zajišťuje úplné kopírování 5 'konce mRNA. Termostabilní RT jsou také navrženy pro použití při vyšších teplotách.

Co syntetizuje reverzní transkriptáza?

Reverzní transkriptáza usnadňuje syntézu DNA z genomu virové RNA. Tato nově vytvořená DNA je známá jako komplementární DNA (cDNA). RT je většinou přítomen ve virech obsahujících genom RNA. Genom RNA obsahující virus je známý jako retrovirus.

Jaká je funkce reverzní transkriptázy?

Reverzní transkriptáza je RNA dependentní DNA polymeráza (pro syntézu cDNA vyžaduje RNA jako templát). RT identifikuje a váže RNA k syntéze single stojaté RNA (ssRNA). Po syntéze cDNA štěpí RT RNA a zahájí syntézu dvouvláknové DNA (dsDNA).   

reverzní transkriptáza má dvě aktivní místa (aktivní místa) k provádění dvou samostatných funkcí:

Aktivní místo polymerázy: obsahuje dvě domény podobné prstům; jedna doména může identifikovat RNA a vytváří vodíkové vazby s fosfátovými skupinami pomocí postranních řetězců.

Tvorba vodíkové vazby přináší konformační změny a usnadňuje uzavření rozpoznávací díry; to má za následek zahájení transkripčního procesu (přidáním nukleotidů) pomocí iontů hořčíku druhé domény.

Flexibilní zóna řídí proces konformační změny; tato flexibilní zóna je přítomna mezi doménami aktivního místa polymerázy. Během biochemických a farmakologických studií se často považuje za cílové místo k inhibici aktivity RT. Aminokyselinová sekvence přítomná ve flexibilní zóně není konzervována (během evoluce se hodně mění), což umožňuje viru vyvinout rezistenci.

Ribonukleáza H doména: je odpovědná za štěpení uvolňování RNA a ssDNA. Hořčíkový iont pomáhá doméně ribonukleázy H rozpoznávat fosfátové skupiny. Druhý řetězec domény H ribonukleázy nemá enzymatickou aktivitu. Pouze interaguje a stabilizuje aktivní místo.

Výzkum stále probíhá přesným katalytickým mechanismem RT; výše uvedené schéma je základní myšlenkou katalýzy prováděné RT.

Na rozdíl od DNA polymerázy RT chybí korektura kvůli absenci Klenowova fragmentu. Nedostatek aktivity korektury vytváří více chyb v přepisu, což vede k obrovským možnostem mutací viru.

Retrovirová reverzní transkriptáza

Virové částice všech retrovirů obsahují multifunkční enzym známý jako RT. Tato RT je nutná k syntéze DNA kopie genomu retrovirové RNA, jakmile vstoupí do hostitelské buňky. 

Stanovení 3D struktury reverzní transkriptázy odhalilo interakce mezi dvěma aktivními místy, včetně vazby a katalýzy. Strukturální znalosti enzymu nám poskytují příležitost studovat nová antivirová léčiva pro léčbu proti retrovirům.

HIV reverzní transkriptáza

Virus lidské imunodeficience (HIV) je zodpovědný za šíření syndromu získané imunodeficience (AIDS). HIV kóduje hlavně čtyři typy proteinových podjednotek vykazujících aktivitu jako DNA polymeráza, RNáza H, integráza a proteáza. Aktivita DNA polymerázy a RNázy H je ovládána jedinou podjednotkou reverzní transkriptázy HIV (heterodimerní enzym).

K přeměně genomové RNA viru na dsDNA v hostitelské buňce vykazuje reverzní transkriptáza HIV aktivitu RNázy H i DNA polymerázy. Výzkum pokračuje v poznání mechanismu, jak HIV reverzní transkriptáza nasazuje svou podjednotku (doménu Ribonukleázy H) k hydrolýze genomu (RNA) retroviru. Místa a konformace reverzní transkriptázy pro syntézu DNA a hydrolýzu RNA jsou různá. Tento rozdíl v konformaci a odhalení strukturální dutiny z něj činí potenciálního cílového kandidáta na inhibici reverzní transkriptázy.

HIVRT
Obrázek: Struktura reverzní transkriptázy HIV během syntézy cDNA. Obvykle má HIV RT dvě aktivní místa. jedno katalytické místo má polymerázovou funkci, zatímco druhé má nukleázovou aktivitu. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcriptase_3KLF_labels.png

Důležité upozornění: Aktivita RNázy H HIV reverzní transkriptázy zcela závisí na aminokyselinové sekvenci aktivního místa. Skutečný mechanismus ještě teprve bude objeven.

Závěry

Tento článek pojednával o událostech transkripce, reverzní transkripci a významu reverzní transkriptázy v retrovirech. Další podrobnosti o souvisejících tématech klikněte zde.

Nejčastější dotazy

Q1 Jaká je role reverzní transkriptázy

Odpovědět enzym RT je také známý jako RNA závislá DNA polymeráza; katalyzuje transkripci retrovirové genomové RNA na cDNA.

Q2 Odkud pochází reverzní transkriptáza

Odpověď: Proces reverzní transkripce se do určité míry vyskytuje u retrovirů, prokaryot a dokonce i eukaryot. Podílí se na syntéze cDNA z RNA. Retroviry mají RT, které jsou závislé na RNA při syntéze cDNA. Jaderné dělení nezahrnuje použití RT. An enzym známý jako telomeráza je přítomen v eukaryotech. Telomeráza je specializovaná RT, která syntetizuje telomerní DNA (přítomnou na špičkách chromozomů) z RNA.

Q3 Které organismy mají reverzní transkriptázu

Odpovědět enzym RT je přítomen v mnoha organismech, jako jsou rostliny, zvířata, bakterie a viry. Úlohou enzymu RT je převést sekvenci RNA na sekvenci cDNA. Je obecný ve všech organismech. Mezi specifické funkce RT patří:

Propagace retroviru

Rozmanitost eukaryotických mobilních transpozonů nebo retrotranspozonů

Replikace nebo syntéza telomer

Syntéza multi-copy single-stranded DNA (msDNA), extrachromosomal DNA / RNA and chimimeric elements.

Q4 Dělají lidé reverzní transkriptázu.

Odpověď: Ano, lidé exprimují reverzní transkriptázy; telomeráza je typ reverzní transkriptázy. Nachází se v mnoha eukaryotech. Lidé přenášejí templát RNA telomerázy za vzniku telomerické DNA.

Q5 Jak zabráníte reverzní transkriptáze

Odpověď: Aktivitě reverzní transkriptázy lze zabránit použitím silných inhibitorů enzymů. Tyto inhibitory (konkrétně pro RT) jsou obecně antiretrovirová činidla. Inhibitory omezují RT tvorbou cDNA z virové RNA, a proto zastaví šíření viru.

Q6 Jaký je rozdíl mezi PCR v reálném čase a reverzní transkriptázou

Odpověď: PCR s reverzní transkriptázou (RT-PCR) je mnohem citlivější než běžná PCR. RT-PCR se často používá k detekci exprese konkrétního genu, sekvenování DNA, klonování DNA, sledování dědičných onemocnění a analýze funkčních genů. Naproti tomu je obecná PCR mnohem více používána pro účely amplifikace DNA.

Q7 Proč se RNA převádí na cDNA

Odpověď: reverzní transkriptáza obvykle přepisuje templátovou RNA do cDNA. 

cDNA se obecně používá v molekulární biologii pro klonování eukaryotické geny do prokaryotické buňky továrny. Kdykoli chceme exprimovat protein (externího zdroje) do buňky, která normálně takový protein nesyntetizuje, potřebujeme transformaci cDNA do továrny prokaryotických buněk.

Q8 Jaký je rozdíl mezi QPCR a RT-PCR

Odpověď: obě techniky jsou vzájemně propojené a využívají se k produkci / amplifikaci kopií DNA. RT-PCR zesiluje reverzní transkripci kódu RNA, zatímco Q-PCR měří proces amplifikace. Q-PCR je pro kvantifikaci, zatímco RT-PCR je pro amplifikace. Q-PCR je kvantitativní, zatímco RT-PCR je nekvantitativní povahy.

Q9 Může reverzní transkriptázu použít jako šablonu DNA.

Odpověď: Reverzní transkriptáza používá jednovláknovou RNA jako templát pro syntézu dvouvláknové kopie DNA. RT nepoužívají DNA jako šablonu.

Q10 Jaká je charakteristická vlastnost reverzní transkriptázy

Odpověď: Charakteristickým rysem reverzní transkriptázy je přenos genetické informace z RNA do DNA. 

Také čtení: