Polymerázová řetězová reakce: 9 důležitých vysvětlení

Obsah

Co je polymerázová řetězová reakce?

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je další široce používaný molekulární biologie technika pro enzymatickou produkci DNA bez použití buněčného aparátu, například kvasinek nebo E. coli. Tato metoda umožňuje omezené množství DNA být zesílen několik záhybů dramaticky. PCR je pravidelně využíván v klinický, forenznía biologické laboratoře pro různé účely, například určování genetické otisky prstů, diagnóza nemoci, genové klonování,  a  otcovské testování. 

Tuto techniku ​​vytvořil v roce 1983 Kary Mullis. PCR je v současné době zásadní a významný postup používaný v aplikované biologii. Tyto obsahují Klonování DNA pro sekvenování, fylogenezi založenou na DNA nebo pro aktivní zkoumání genové exprese a stanovení geneticky přenosných chorob. V roce 1993 získal Mullis za práci na PCR Nobelovu cenu za chemii. 

PCR se obecně provádí v reakční směsi o celkovém objemu 0.1-0.2 ml v reakčních zkumavkách (objemy 0.2-0.5 ml) v přístroji známém jako termální cyklovač. Termální cyklovač ohřívá a ochlazuje DNA, aby dosáhl teplot požadovaných v každém kroku reakce. Tenkostěnné reakční trubice poskytují požadovanou tepelnou vodivost umožňující rychlejší tepelnou ekvilibraci. Tepelné cyklovače mají obvykle vyhřívané vrcholy nebo víko, které brání kondenzaci reakčních složek v horní části trubky. 

Požadavky polymerázové řetězové reakce

• DNA fragment, který má být amplifikován (templátová DNA nebo cDNA)
• Primery (přímý primer a reverzní primer) schopný rozpoznávat konce templátové DNA. Primery jsou obvykle 18-25 párů bází dlouhé.
• Termostabilní DNA polymeráza (Taq polymeráza) katalyzuje syntézu DNA. Taq polymeráza se získává z Thermus aquaticus.
• Nukleotidy
• Bufferu (poskytuje optimální médium pro aktivitu termostabilní DNA polymerázy)

Pracovní princip polymerázové řetězové reakce

PCR se nazývá řetězová reakce, protože nově syntetizovaná vlákna budou působit jako templát pro další syntézu DNA v následujících cyklech. 

PCR se skládá ze 3 po sobě následujících reakcí:

• Denaturace DNA: Proces denaturace odděluje vlákna dvouvláknové DNA. Pro lidskou DNA, denaturační teplota je asi 93-95oC. Denaturace DNA se provádí přerušením vodíkových vazeb mezi dvěma polynukleotidovými řetězci DNA. Denaturační proces se často provádí po dobu 5 minut nebo delší dobu, aby se zajistilo, že oba řetězce templátové DNA jsou od sebe zcela odděleny. Proces denaturace také aktivuje termostabilní DNA polymerázu.
• Žíhání primeru: Po denaturaci se do reakční směsi zavedou přímý a reverzní primer. Roztok se poté ochladí pro žíhání primeru. K žíhání primeru obvykle dochází mezi 50–70^oC v závislosti na Tm (teplota tání) DNA. V ideálním případě je teplota žíhání 5^oC pod Tm. Teplota nasedání by měla být nízká, aby se vytvořil hybrid mezi primerem a templátovou DNA, a dostatečně vysoká, aby se zabránilo neodpovídajícím hybridům. Tm DNA závisí pouze na obsahu GC a AT v DNA. Krok žíhání primeru obvykle trvá 1-2 minuty. Tm lze určit experimentálně nebo vypočítat teoreticky podle vzorce uvedeného níže:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]^oC

• Syntéza DNA: Termostabilní DNA polymeráza (Taq polymeráza) se váže v blízkosti RNA vazebnou oblast a inkorporuje volné nukleotidy prodloužit a syntetizovat nový řetězec DNA sousedící s templátovým řetězcem. Optimální teplota extenzního kroku závisí na typu použité polymerázy; pro Taq polymerázu je optimální teplota asi 72^oC. Trvání tohoto kroku prodloužení závisí na délce templátové DNA a účinnosti termostabilní DNA polymerázy; obvykle je to jeden pár kilobází za minutu.

Všechny výše uvedené reakce se opakují 30krát, aby se získalo přibližně 1 miliardu kopií templátové DNA.

Fáze polymerázové řetězové reakce

Proces PCR je rozdělen do tří fází:

• Exponenciální zesílení: DNA polymeráza plní optimální funkci a po dokončení každého cyklu se množství produktu zdvojnásobí. V počátečním bodě reakce musí být přítomno pouze malé množství DNA, protože reakce je velmi citlivá.
• Vyrovnávací stupeň: DNA polymeráza vykazuje nižší aktivitu z důvodu menší dostupnosti činidel, jako jsou nukleotidy.
• Zásobník: v důsledku vyčerpání činidla již nevzniká žádný produkt.

Využití polymerázové řetězové reakce

Pomocí PCR lze identifikovat četné abnormality spojené s genomem, širokou škálu analýz a experimentů. Níže uvádíme několik příkladů použití PCR:

• Identifikace infekčních agens, jako je CMV, mykoplazma, pneumonie, nakažlivá a protozoální onemocnění, hepatitida atd. Ve vzorku.
• Stanovení malignity, zejména v případě lymfomu a leukémie. 
• Testování otcovství a genetické otisky prstů. 

PCR umožňuje včasnou identifikaci abnormalit, které jsou v současnosti ve výzkumu rakoviny nejrozvinutější. Opatření PCR lze provádět přímo na vzorcích genomové DNA k rozpoznání translokačně specifických maligních buněk s citlivostí více než 10,000 XNUMXkrát ve srovnání s jakoukoli jinou metodou. 

PCR také identifikuje nekultivovatelné a pomalu rostoucí mikroorganismy, jako jsou mykobakterie, anaerobní mikroorganismy a viry, z technik tkáňové kultury a zvířecích modelů. PCR demonstrativní aplikace v mikrobiologii jsou rozpoznávání patogenů a schopnost rozlišovat mezi nepatogenními a patogenními kmeny identifikací specifických genů. 

PCR se používá k zesílení krátkého kousku řetězce DNA. Tento řetězec DNA může být úplným genem nebo pouze částí genu. Na rozdíl od živých systémů může cyklus PCR amplifikovat jen krátké fragmenty DNA až 10 párů kilobází. Různé další techniky mohou amplifikovat fragmenty DNA až do velikosti 40 kb, což je stále méně než velikost chromozomální DNA eukaryotické buňka – například lidská buňka obsahuje přibližně tři miliardy párů nukleotidových bází. 

Otcovské testování lze provést pomocí PCR odebráním DNA jedinců, kteří mají spor. DNA testovaných jedinců je amplifikována a štěpena restrikční enzymy a analyzovány gelovou elektroforézou. Vzor fragmentů DNA na agrosovém gelu je znám jako otisk DNA jedince. Blízcí nebo pokrevně příbuzní jedinci to budou mít podobné Otisky DNA vzor ve srovnání se vzdáleně příbuznými nebo nepříbuznými jedinci. Získané otisky mohou být dále analyzovány pro rodiče-dítě nebo sourozence se dvěma nebo více genetickými (DNA) otisky prstů. The Získané otisky DNA lze použít k poznání evoluční vztahy mezi organismy. 

Jeho velikost může snadno rozpoznat konečný produkt PCR elektroforéza na agarózovém gelu. Elektroforéza na agarózovém gelu se provádí vstřikováním vzorků DNA do agarózového gelu. Elektrický proud prochází agarózovým gelem, aby se zjistila mobilita vzorků DNA. Menší fragmenty DNA se v gelu pohybují rychleji a naopak. Produkt PCR a fragment DNA vzorku jsou identifikovány zavedením žebříčku DNA do agarózového gelu. Žebřík DNA obsahuje molekuly DNA známé velikosti. 

Dříve byla identifikace genetické poruchy pozorováním genomu obtížná práce. Později se vývojem PCR tento proces zkrátil. Jakýkoli požadovaný gen může být snadno amplifikován pomocí vhodných primerů a poté sekvenován pro detekci mutací v DNA. Včasnou identifikaci některých smrtelných virových infekcí lze provést také pomocí PCR. 

Druhy polymerázové řetězové reakce

Na základě některých vhodných úprav v technice, Polymerázová řetězová reakce je klasifikován do následujících typů:

• Vnořená PCR
• Inverzní PCR
• Reverzní transkripce (RT-PCR)
• Asymetrická PCR
• Kvantitativní (PCR-Q-PCR)
• Kvantitativní real-time PCR (QRT-PCR)
• Touchdown PCR
• Kolonie PCR
• Alelově specifická PCR
• Sestava PCR nebo Polymerase Cycling Assembly (PCA)
• Asymetrická PCR
• Lineární po exponenciální PCR (LATE-PCR)
• Dial-out PCR
• Zesílení závislé na helikáze
• Hot start PCR
• Inter-sekvenčně specifická PCR
• Inverzní PCR
• Ligací zprostředkovaná PCR
• Methylačně specifická PCR
• Miniprimer PCR

Výhody polymerázové řetězové reakce

• Polymerázovou řetězovou reakci lze použít k identifikaci různých genetických abnormalit.
• PCR se používá v celé řadě laboratorních experimentů a postupů v molekulární biologii.
• PCR dokáže detekovat malignity, jako je leukémie, lymfom atd., A různé další stavy, jako je Toxoplasma gondi, stafylokoková bakteremie, malarické infekce atd.
• Genetické otisky prstů a testování otcovství zahrnují jako klíčový krok PCR.
• Vysoká citlivost a specificita PCR z něj činí důležitý nástroj pro experimenty založené na biotechnologii a molekulární biologii.

Nevýhody polymerázové řetězové reakce

• Polymerázová řetězová reakce vyžaduje termální cyklovač, elektroforetické sestavení DNA, izolační soupravu DNA a další nákladné chemikálie, které tento proces prodražují.
• Vyžaduje vyškolených, kvalifikovaných a zkušených techniků pro provádění experimentů.
• Jsou vyžadovány základní bezpečnostní úrovně s odvlhčovačem a zařízením pro laminární proudění.
• Je těžké si dovolit testování na bázi PCR pro běžnou veřejnost.
• Ne všechna onemocnění mohla být identifikována a diagnostikována pomocí PCR.
• Možnost získání falešně pozitivních a falešně negativních výsledků.

Závěry:

Polymerázová řetězová reakce je běžně používanou a široce přijímanou technikou pro identifikaci několika smrtelných infekčních agens s citlivostí a specificitou. PCR se používá v různých pokročilých zdravotnických zařízeních, moderních laboratořích a lékařských ústavech jako rutinní diagnostický a výzkumný modul. Polymerázová řetězová reakce hraje klíčovou roli při identifikaci abnormalit představujících atypické klinické příznaky; PCR umožňuje včasnou detekci těchto typů poškození. Včasné odhalení může pomoci lépe zvládat jednotlivce, což může snížit sociální a ekonomickou zátěž pro rodinu subjektu.

Chcete-li se dozvědět více o dalších tématech o biosyntéze a biotechnologii klikněte zde

Koncept Checker MCQ

Otázka č. 1: Student provádí PCR k amplifikaci vzorku templátové DNA. Ale v experimentu zapomněl přidat primer DNA. Která z následujících možností představuje nejlepší možný výsledek?

A- Reakce nebude probíhat.

B- reakce bude fungovat, ale proces bude amplifikovat nespecifické oblasti (ne požadovanou část DNA v DNA.

C- Reakce bude fungovat, ale s prodlouženou rychlostí

D- Reakce bude fungovat a produkt bude vykazovat nežádoucí mutace.

Varianta A: „Reakce neproběhne“, je správná odpověď.

Vysvětlení: Primery jsou nezbytné pro fungování PCR. Taq polymeráza je potřebuje k navázání (v kroku žíhání), aby se iniciovala replikace DNA. PCR tedy nebude fungovat v nepřítomnosti primerů a nebude probíhat žádná amplifikace.

Otázka č. 2: Student / výzkumný pracovník chce vložit gen lidského hemoglobinu do expresního vektoru pro klonování a expresi genu v myších buňkách pro analýzu výsledného fenotypu. Který z následujících sledů postupů umožní studentovi / výzkumníkovi úspěšně klonovat gen?

Varianta A:

1. Amplifikujte gen pomocí PCR

2. Pro štěpení expresního vektoru použijte restrikční enzym

3. Ligátový gen a natrávený vektor

Varianta B: 

1. Ligátový gen

2. Pro štěpení expresního vektoru použijte restrikční enzym 

3. Amplifikujte gen a natrávený expresní vektor pomocí PCR

Možnost C:

1. Pro štěpení expresního vektoru použijte restrikční enzym

2. Amplifikujte gen pomocí PCR

3. Ligátový gen a natrávený vektor

Varianta D:

1. Pro štěpení expresního vektoru použijte restrikční enzym

2. Ligátový gen a natrávený vektor

3. Amplifikujte gen pomocí PCR

Varianta A: Je opravit volba 

1. Amplifikujte gen pomocí PCR

2. Pro štěpení expresního vektoru použijte restrikční enzym

3. Ligátový gen a natrávený vektor

Vysvětlení: Nejprve použijeme PCR k amplifikaci požadovaného genu z lidského genomu s restrikčními místy na koncích (to pomůže jeho ligaci do restrikce štěpený enzymem vektor). Později musí být expresní vektor štěpen pomocí stejného restrikčního enzymu a poté byly štěpený vektor a amplifikovaný gen ligovány dohromady. Konečný produkt se bude skládat ze dvou segmentů: původního vektoru a požadovaného genu.

Otázka č. 3: Který nástroj se používá k dokončení amplifikace DNA pomocí PCR?

A- Genetický analyzátor

B - UV spektrofotometr

C- termocykler

D- Odstředivka

Možnost C: Správná odpověď je termocykler

Vysvětlení: Termocykler může být nastaven tak, aby provozoval cyklus denaturačních, žíhacích a prodlužovacích fází v malém množství reakčního objemu. K provedení amplifikace PCR se používá termální cyklovač.

Další příspěvek na téma Advance science naleznete na tento odkaz.