DNA Supercoiling: 7 kompletních rychlých faktů

by

Obsah

Co je to supercoiling? | DNA Supercoiling

Jak všichni víme, DNA buňky je velmi zhutněná, což vede k vyšší úrovni strukturální organizace. Skládací mechanismus DNA zabalí buněčnou DNA tak, aby informace uvnitř DNA zůstala přístupná.

Musíme pečlivě prozkoumat základní strukturu DNA, abychom lépe porozuměli replikaci a transkripčnímu procesu DNA. Musíme mít předchozí znalosti o zásadní vlastnosti struktury DNA, která je supercoiling.

Supercoiling znamená další navíjení svinuté struktury. Řekněme například, že telefonní kabel je obvykle stočený vodič. Drát mezi tělem telefonu a přijímačem často obsahuje alespoň jednu supercoil. Tyto dva řetězce DNA se omotávají kolem sebe a vytvářejí strukturu dvojité šroubovice DNA. Navíjení v ose DNA způsobuje supercoiling. Supercoiling v DNA je z větší části znakem strukturálního napětí. Pokud nedochází k žádnému výslednému ohybu DNA, je DNA považována za uvolněnou.

Superšroubovice DNA
Obrázek: Superšroubovice DNA, úrovně superšroubovicí nalezené v DNA. Stručně to připomíná navinutí telefonního drátu
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Epigenetic_mechanisms.png

Můžeme očekávat, že proces zhutňování DNA zahrnoval určitou nadšroubovici. Možná méně nepřekvapivé je, že replikace a transkripce DNA dále ovlivňují a jsou ovlivňovány supercoilingem. Replikace a transkripce vyžadují oddělení DNA řetězců a šroubovicové odvíjení DNA.

  • Že by se DNA sama zkroutila a stala by se svinutá v kompaktně zabalené DNA v buňce, by se v tom okamžiku jevila jako rozumná a možná dokonce bezvýznamná.
  • Několik kruhových molekul DNA však zůstává výjimečně nadšroubovicových i po jejich extrakci a čištění.
  • To naznačuje, že supercoiling je vnitřní vlastností DNA. Děje se to v každé buněčné DNA a je výjimečně regulováno každou buňkou.
  • Různé měřitelné vlastnosti supercoilingu byly standardizovány a výzkum supercoilingu přinesl řadu vhled do struktury DNA a její funkce.
  • Toto šetření je založeno na myšlenkách z topologie a zkoumání vlastností objektu, který se za dynamických podmínek nemění.

U DNA konzistentní deformace začleňují konformační změny z důvodu tepelného pohybu nebo interakce proteinů nebo jiných chemických látek; občasné deformace zahrnují zlomení řetězce DNA. Pro kruhovou DNA nejsou topologické vlastnosti ovlivněny strukturálními změnami v řetězcích DNA, pokud nejsou přítomny zlomy řetězce. Topologické vlastnosti jsou narušeny výlučně rozbitím páteře cukr-fosfát a opětovným spojením kteréhokoli z řetězců DNA. V současné době zkoumáme základní charakteristiky a fyzikální základy supercoilingu.

Většina buněčné DNA je poškozená

Abychom rozpoznali nadšroubovici, měli bychom se zpočátku soustředit na charakteristiky malých kruhových DNA, jako jsou malé virové DNA a plazmidy. Pokud DNA nemá zlomy v žádném řetězci, považuje se to za uzavřenou kruhovou DNA. Předpokládejme, že DNA kruhové molekuly DNA se těsně vyrovná a vytvoří strukturu ve formě B, jak uvádí Watson-Crick. Jeden tah B-DNA se skládá z 10.5 bp; potom je DNA uvolněná místo nadšroubovicová.

Supercoiling je pozorován, když je DNA vystavena strukturálnímu napětí. Vyčištěná kruhová DNA se velmi zřídka nachází v uvolněném stavu, bez ohledu na její původ. Kromě toho má DNA charakteristický stupeň převinutí v závislosti na zdroji nebo původu. Struktura DNA je napnutá, aby mohla podstoupit supercoiling. Téměř v každém případě je kmen výsledkem přetočení kruhové dvojité šroubovicové DNA.

  • To znamená, že DNA má méně spirálových závitů než struktura B-DNA.
  • B-DNA obsahuje v jednom tahu 10.5 párů bází (bp).
  • Takže 84bp fragment uvolněné kruhové DNA by měl osm šroubovicových obratů. Nebo jedno otočení za každých 10.5 bp.
  • Pokud by byl jeden z těchto tahů odstraněn, bylo by v B-DNA nalezeno (84 bp) / 7 = 12.0 bp za kolo, místo 10.5.

Je to odchylka od nejstabilnější formy struktury DNA a molekula DNA je podle toho termodynamicky namáhána. Obvykle by se spousta kmene uvízla navinutím osy DNA na sebe, aby se vytvořila supercoil, část kmene v této 84 bp sekci by se jen rozptýlila v nekroucené struktuře větší částice DNA).

Na základní úrovni lze kmen vyvolat segregací dvou řetězců DNA na vzdálenost asi deseti bp.

V kruhové DNA se kmen prezentovaný podvinutím obvykle namotává navíjením místo segregace řetězců, protože navíjení v ose DNA obvykle potřebuje méně energie než rozbití vodíkových vazeb mezi komplementárními páry bází. 

Důležitá poznámka: bez ohledu na to, že podvinutí DNA in vivo usnadňuje oddělování řetězců DNA a nabízí přístup ke genetickým informacím, které obsahují.

Každá buňka neustále podmotává svou DNA pomocí enzymatických cyklů a následný napjatý stav představuje jakousi uloženou energii. Buňky udržují DNA v podvinuté formě, takže se může snadno svinout. Podvinutí DNA je pro DNA kriticky důležité metabolizující enzymy které potřebují separaci vláken jako součást své funkce.

Podmíněný stav je jako takový udržován pouze v případě uzavřené kruhové DNA, nebo musí být navázán na proteiny (histony), aby se vlákna kolem sebe neobtočila. Pokud se zlomí řetězec kruhové DNA, který je segregovaný a neváže se na bílkoviny, volný pohyb nebo rotace v bodě způsobí, že se podvázaná DNA okamžitě vrátí do uvolněného stavu. V kruhové DNA udává počet šroubovicových závitů stupeň nadšroubovice.

Topologické spojovací číslo definuje DNA Underwinding

Topologie poskytuje různé myšlenky, které jsou pro tuto konverzaci užitečné, zejména myšlenka propojení čísla. Spojovací číslo je vlastnost založená na topologických charakteristikách dvojité šroubovicové DNA, protože se nezmění, pokud se DNA deformuje nebo ohýbá bez porušení. Spojovací číslo (Lk) je uvedeno v.

Měli bychom začít zobrazením segregace dvou řetězců dvojité šroubovicové kruhové DNA. Pokud jsou tyto dva prameny spojeny, jsou produktivně spojeny topologickou vazbou. Bez ohledu na všechny interakce stohování bází a vodíkové vazby se topologická vazba stále spojuje se dvěma řetězci.

Pokud vezmeme v úvahu jedno vlákno kruhové DNA jako povrch (například mýdlový film), spojovací číslo je zobrazeno jako počet povrchových průniků způsobených druhým vláknem. Pro kruhovou DNA je spojovací číslo vždy celočíselná hodnota.

Konvenčně je spojovací číslo pozitivní, když se řetězce dvojité šroubovice DNA prolíná v šroubovici pravou rukou. Pokud se řetězce dvojité šroubovice DNA propletou v šroubovici pro leváky, spojovací číslo bude negativní. Negativní spojovací čísla nejsou v DNA prakticky nalezena.

Když je kruhová molekula DNA uvolněná, spojovací číslo lze snadno určit několika páry bází v molekule DNA párem bází za otáčku (~ 10.5). U kruhové DNA s 2100 bp bude vykazovat spojovací číslo 200.

Spojovací číslo se vypočítá pro ty molekuly DNA, které se nerozbijí v žádném z řetězců DNA. V případě rozpadu vlákna topologické vazby neexistují; spojovací číslo proto zůstává nedefinované.

Nyní jsme schopni vykreslit podvádění DNA v důsledku změny spojovacího čísla. Spojovací číslo v uvolněné DNA, Lk0, je využíván jako zdroj perspektivy (reference). Pro molekulu DNA se spojovacím číslem = 200 (Lk0 = 200), pokud jsou z této molekuly DNA vytaženy nebo odstraněny dvě otáčky, Lk = 198. Rovnice může vykreslit změnu:

∆Lk = Lk - Lk0

∆Lk = 198-200 = -2

Je mnohem lepší vyjádřit změnu spojovacího čísla pomocí specifického spojovacího rozdílu (σ) nebo superhelikální hustoty (toto množství nezávisí na délce DNA). Specifické spojovací číslo je matematicky definováno jako počet odstraněných závitů (změna spojovacího čísla) dělený několika obraty přítomnými v uvolněném stavu DNA.

σ = ∆Lk / Lk0

takže pro molekulu DNA, která má spojovací číslo 200, pokud se z ní odstraní dvě otáčky, stane se specifický spojovací rozdíl

σ = -2/200 = -0.01 

prokazuje, že jsou odstraněny 2 z 200 (1%) z celkových šroubovicových závitů přítomných v molekule B-DNA.

Pozitivní Supercoiling | Negativní Supercoiling

Stupeň podmotání buněčné DNA je obecně 5% až 7%; tj. -0.05 až -0.07. Toto negativní znaménko ukazuje, že se očekává, že změna spojovacího čísla bude pod větru nebo z důvodu podvázání DNA. Supercoiling spuštěný underwinding je tímto způsobem charakterizován jako negativní supercoiling. Alternativně může za určitých podmínek dojít k přetočení DNA, což povede k pozitivní superšroubovici.

Důležité upozornění: Cesta zkroucení v ose DNA způsobená pozitivním nadšroubovením (převinutá DNA) je zrcadlovým obrazem zkroucení osy DNA způsobeným negativním nadšroubovením (podvinutá DNA).

Supercoiling rozhodně není svévolná interakce; nadšroubovení je obecně řízeno torzním namáháním přenášeným na DNA zvýšením nebo snížením spojovacího čísla B-DNA. 

Propojení počtu změn o jednu zlomením jednoho řetězce DNA, otočení jednoho z konců o 360o o vláknu (neporušené) a opětovné připojení zlomených konců B-DNA.

Tato změna nenarušuje počet párů bází nebo atomů v kruhové DNA. Jsou nazývány dva typy kruhové DNA, které se liší topologickou vlastností (například spojovací číslo) topoizomery.

pozitivní a negativní supercoiling
Obrázek: Znázornění pozitivní a negativní supercoiling v DNA https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/98/Subhash_nucleoid_06.png

Propojovací číslo lze rozdělit na dvě primární komponenty známé jako Twist (Tw) a Writhe (Wr). Ty se zobrazují hůře než spojovací číslo. Přesto může být svíjení považováno za akt navíjení spirálové osy a Twist je určen jako prostorový vztah sousedních párů bází a lokálního kroucení. V tomto bodě vede změna spojovacího čísla ke změně poměru kmene, který je normálně nahrazen svinutím (supercoiling) a několika změnami v Twistu, následuje rovnice:

Lk = Tw + Wr

Tw a Wr nemusí být nutně celá čísla. Writhe a Twist jsou geometrické vlastnosti místo topologických vlastností, protože zkreslení je může změnit v kruhové DNA.

Způsobují překroucení a podstatně zjednodušují segregaci vláken. Podvinutí DNA funguje v konjugaci s několika dalšími strukturálními změnami v kruhové DNA. Ty mají menší fyziologický význam, nicméně pomáhají ukázat dopady underwinding.

Křížový kříž obvykle obsahuje několik nepárových základen; Podvádění DNA pomáhá udržovat nezbytnou separaci řetězců. Pravostranné dvojité šroubovité DNA vede k tvorbě krátkých míst levostranné Z-DNA na místech s konzistentní nukleotidovou sekvencí se Z-DNA.

Topoizomeráza | Změna spojovacího čísla | Zavedení negativní supercoilingu

Supercoiling DNA je proces, který ovlivňuje metabolismus DNA. Každá buňka má specifické enzymy s jedinou schopností podmotávat nebo potenciálně uvolňovat dvojitou šroubovici DNA. Enzymy, které způsobují úbytek nebo zesílení navíjení DNA, jsou známé jako topoizomerázy; obvykle mění spojovací číslo DNA, aby udržovaly nadšroubovici.

topoizomeráza
Obrázek: Mechanismus účinku a inhibice topoizomerázy
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Topoisomerase_DNA.gif#/media/File:Topoisomerase_DNA.gif

Tyto enzymy vykazují obzvláště významnou roli v procesu balení DNA a replikace DNA. Široce topoizomeráza je rozdělena do dvou hlavních typů:

  • Topoizomerázy typu I rozbíjí jedno vlákno z dvojité šroubovicové DNA. Prochází neporušeným řetězcem DNA mezerou a liguje zlomený konec; topoizomeráza typu I přináší změnu Lk s přírůstkem 1. 
  • Topoizomerázy typu II rozbíjejí obě řetězce dvojité šroubovicové dvojité šroubovice DNA a mění Lk o přírůstek 2.

Dopady topoizomeráz na topologii DNA lze popsat gelovou elektroforézou (agaróza). Populace podobných plazmidových DNA se stejným spojovacím počtem cestuje během elektroforézy jako diskontinuální pás. Touto technikou lze izolovat topoizomery, které se liší jen o 1 Lk, takže lze snadno identifikovat změnu spojovacího čísla vyvolanou topoizomerázami.

E. coli má čtyři charakteristické jednotlivé topoizomerázy (I až IV). Typ I (zahrnuje topoizomerázy I a III): 

obvykle uvolňují dvojitou šroubovice DNA eliminací negativních supercoilů (tedy zvyšováním hodnoty Lk). Jak bakteriální topoizomerázy typu I zvyšují počet vazeb, je vysvětleno v textu. Bakteriální topoizomeráza typu II nebo DNA gyráza je schopna vyvolat negativní supercoily a případně snížit hodnotu Lk.

K dosažení tohoto cíle využívá energii ATP. Chcete-li změnit spojovací počet dvojité šroubovice DNA, topoizomerázy typu II oddělují dva řetězce dvojité šroubovice DNA a později umožňují průchod dalším duplexem přes zlom. Úroveň převinutí bakteriální DNA je zcela pod regulací topoizomeráz I a II. Eukaryota dále obsahují topoizomerázy typu I i typu II.

Topoizomerázy I a III patří do třídy enzymů typu I; zatímco enzymy typu II zahrnují topoizomerázy II-α a II-β. Eukaryotické topoizomerázy typu II nemohou poddimenzovat DNA (vyvolat negativní supercoiling), přesto mohou uvolnit negativní a pozitivní supercoiling.

supercoiling a negativní indukce
Obrázek: Indukce negativního nadzávitu v DNA https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Subhash_nucleoid_04.png#/media/File:Subhash_nucleoid_04.png

Budeme zvažovat jeden pravděpodobný začátek negativních supercoilů eukaryotické buňky v našem rozhovoru o chromatinu v naší pozdější diskusi.

Zhutnění DNA vyžaduje Supercoiling

Dvojitá šroubovice nadšroubovicové DNA je v různých ohledech jednotná. Supercoiling je pravák v molekule DNA, která je negativně supercoiled, a mají tendenci být úzké a rozšířené místo toho, aby vykazovaly kompaktní strukturu s mnoha větvemi. Při této superhelikální hustotě, která se typicky vyskytuje v buňkách, představuje délka osy svitku s větvemi přibližně 40% celkové délky DNA.

Tento typ Supercoiling je známý jako plectonemic Supercoiling (je to kombinace řeckých slov „plektos“ znamená „zakřivený“ a „nema“ znamená „řetězec“).

Tento termín se vztahuje na jakýkoli design s vlákny pravidelně prokládanými a jedná se o slušný popis celkové struktury nadšroubovicové DNA v Plectonemic Supercoiling. Struktura zobrazená v oddělených DNA v laboratoři neposkytuje adekvátní zhutnění zabalené buněčné DNA. Druhý typ Supercoilingu, známý jako solenoidní, může být produkován podmotanou DNA.

Struktura solenoidového vlákna 30 nm blíže a dále
Obrázek: Příklad solenoidní nadšroubovice nalezené v DNA https://en.wikipedia.org/wiki/File:Solenoid_30_nm_fibre_structure_closer_and_farther_away.png

Na rozdíl od plektonemické formy (charakterizované prodlouženou pravou rukou Supercoiling), solenoidní Supercoiling je charakterizována těsnými zákruty levé ruky. Bez ohledu na to, že se jejich struktury od sebe drasticky liší, jsou solenoidní a plectonemické dva typy negativních nadzávitů, které může podobný fragment podvázané DNA pojmout.

Tyto dvě struktury jsou často zaměnitelné. Plektonemická struktura je však stabilnější. Solenoidní struktura je ale často stabilizována vazbou na proteiny, což je struktura nalezená v chromatinu. Poskytuje mnohem vyšší úroveň zhutnění. V solenoidní nadšroubovici přispívá podvinutí ke zhutnění DNA.

Závěry

V tomto článku jsme podrobně diskutovali o mechanismu supercoilingu DNA a enzymech a proteinech zapojených do procesu supercoilingu. V nadcházejících příspěvcích budeme i nadále diskutovat o dalších aspektech DNA. Vědět o složení DNA klikněte zde

Rozhovor Otázky a odpovědi

Q1 Proč je pozitivní Supercoiling důležitý?

Odpověď: Pozitivní superšroubení DNA usnadňuje odvíjení DNA z histonů a mění strukturu nukleosomů in vitro; naopak, nukleosomy rychle tvoří negativní DNA nadšroubovicovou. Uvažuje se tedy, že v každém případě transkripce je pozitivní Supercoiling tlačena za RNA polymerázou. Akumulované pozitivní torzní napětí spouští změny v nukleosomech a vytváří podmínky, za kterých se polymeráza efektivně přepisuje celým nukleosomálním uspořádáním.

Q2 Je supercoiling dobrý nebo špatný?

Odpověď: Supercoiling DNA je důležitý, protože DNA je velmi dlouhá molekula a musí zapadat do buňky o poloměru řádově mikrometrů. Vyžaduje opakovanou smyčku uvnitř smyček vinutí, aby se vešly, tento typ vinutí je známý jako Supercoiling. Reguluje také proces transkripce a replikace. 

Q3 Jak se zvyšuje pozitivní Supercoiling DNA?

Odpověď: K pozitivní nadšroubovici DNA dochází, když je pravotočivá dvojitá šroubovice DNA ohnutá mnohem pevněji (zkroucená v designu s pravou rukou), dokud se šroubovice nezačne uzlovat.

Q4 Negativní Supercoiling v bakteriích

Odpověď: Bakteriální DNA obecně vykazuje negativní Supercoiling v bakteriálních buňkách, protože obsahuje nedostatek šroubovicových závitů. Ve své struktuře B-DNA vytvářejí řetězce dvojité šroubovice DNA každých 10.5 párů bází jedno úplné otočení. Zvýšení počtu závitů zpřísňuje dvojitou šroubovici DNA a vede k tomu, že se svíjejí kvůli axiálnímu navíjení dvojité šroubovice DNA. Odstranění zatáček podvinutím duplexu má opačný dopad, takže duplex se svíjel negativně.

Q5 Proč je negativní Supercoiling důležitý?

Odpověď: Negativní Supercoiling má významnou přirozenou funkci segregace řetězců DNA během replikace a transkripce. Separace pramenů snižuje torzní napětí v negativní nadšroubovicové DNA. Tímto způsobem je energeticky méně nákladné oddělit řetězce v negativní nadšroubovicové DNA než v uvolněné DNA a rozdíl v energii zajišťuje relaxace DNA.

Q6 Proč pozitivně nadšroubovicová DNA dělá DNA stabilnější při vysokých teplotách?

Odpověď: Pozitivní superšroubení DNA zvyšuje počet vazeb mezi dvěma řetězci DNA. Konformace, která poskytuje odolnost proti tepelně indukované denaturaci dvojité šroubovice DNA, ji činí stabilní za hyperterofilních podmínek. plasmidy izolované z bakterie žijící v hypertermofilních podmínkách vykazovaly vyšší spojovací číslo ve srovnání s plazmidy izolovanými z bakterie, která za těchto podmínek nežila.

Otázka č. 7 Proč plazmová DNA se supercoilem migruje agarózou s nejmenší rezistencí ve srovnání s jinou formou ex lineární?

Odpověď: Kvůli své nadšroubovicové povaze se fragmenty DNA zmenšují a tím dochází k menší třecí obstrukci gelu - to vede k rychlejšímu pohybu této formy DNA než k jiným formám.

Q8 Jaký je rozdíl mezi omezenou a neomezenou superšroubovicí DNA?

Odpověď: Slovo „neomezený“ se používá k vykreslení Supercoiling ve „volné“ DNA z důvodu topologické zátěže. Není podporován ani závislý na proteinech, což stojí za to u eukaryot, kde je kolem nukleosomu stočeno zhruba 147 párů bází DNA, což je v podstatě histonový oktamer vyrobený ze 2 jednotek histonů H2A, H2B, H3 a H4. Tento typ Supercoiling je klasifikován jako „omezený“, protože ho omezuje struktura nukleosomu.

Q9 Který enzym pomáhá rozřezat jedno vlákno duplexu DNA k uvolnění navíjení dvou řetězců?

Odpověď: Topoizomeráza provádí řez v řetězci a uvolňuje navíjení. Topoizomerázy typu I rozbíjí jedno vlákno z dvojité šroubovicové DNA. Prochází neporušeným řetězcem DNA mezerou a liguje zlomený konec; topoizomeráza typu I přináší změnu Lk přírůstkem 1. Topoizomerázy typu II rozbíjejí obě řetězce dvojité šroubovicové DNA, dvojité šroubovice a mění Lk přírůstkem 2.

Q10 Jsou bakteriální plazmidy kulaté, nebo jsou supercoilové?

Odpověď: U mnoha druhů je bakteriální DNA kruhová a negativně převinutá. Plazmid purifikovaný z Escherichia coli ve střední růstové (exponenciální) fázi je navinut na stupeň σ = -0.06. Uvnitř buňky je neomezená Supercoiling asi polovina této hodnoty.

Také čtení:

     

Zanechat komentář