Redukce disulfidů: Jak, co, metody a několik faktů

Existuje mnoho způsobů, jak provést redukci disulfidů, ale v tomto článku se blíže přiblížíme k redukčním činidlům, která se obvykle používají.

Nejběžnějšími a standardními redukčními činidly používanými pro redukci disulfidů jsou DTT (dithiothreitol) a BMS (beta-merkaptoethanol), existuje také mnoho dalších na bázi fosfinu, thiolu a monothiolu, které budou podrobně popsány v následujících částech.

Co je disulfidové redukční činidlo?

Činidla, která redukují disulfidové vazby (spojení disulfurou), jsou známá jako disulfidová redukční činidla. Existuje mnoho metod, kterými lze redukci provést.

Jak lze redukovat disulfidové vazby?

Víme, že vazba, která vzniká spojením síra atomů je známá jako disulfidová vazba.

Proces, kde dochází k vzájemné přeměně dithiolu na disulfidové skupiny nebo naopak, následuje po redoxní reakci. Ale zde v tomto článku budeme podrobněji přistupovat k procesu redukce disulfidů. Jak tedy můžeme dosáhnout procesu snižování disulfidové vazby? Existuje mnoho způsobů. Redukční činidla můžeme použít pro redukci disulfidových vazeb.

Pod pojmem redukční činidla rozumíme to, že jde o sloučeninu, která má potenciál ztratit nebo je schopna darovat elektron (oxidační činidlo).

To vše se děje v a redoxní reakce. Jak víme, disulfidová vazba se většinou nachází v proteinech. Abychom porozuměli procesu redukce disulfidů, uvažujme příklad inzulínu (proteinu).

Terciární struktura, jak je znázorněna na obrázku, po přidání redukčního činidla způsobuje denaturace proteinu, (to znamená, že je snížena). Pro lepší pochopení se podívejte na obrázek.

Přečtěte si více o:Příklady disulfidových vazeb: Několik faktů

Co snižuje disulfidové vazby v proteinech?

Na redukci disulfidů se podílí mnoho redukčních činidel, zde byly diskutovány tři kategorie, jmenovitě dithiol, fosfin a monothiol.

Projekt redukční činidla zahrnující dithiol zahrnují DTT (dithiothreitol), BMMP (bis (merkaptomethyl)) pyrazin, BMS (Boran dimethylsulfid), DMH (1, 2 – dimethylhydrazin), DTBA (dithiobutylamin a mnoho dalších. Mezi fosfiny patří TCEP (tris ( 2-karboxyethyl)fosfin), TBP (tributylfosfin) a THPP (Tris (3-hydroxypropyl)fosfin) A ten, který má monothiol, je β-ME (beta-merkaptoethanol).

Z výše uvedených činidel jsou nejběžněji používaná redukční činidla pro redukci disulfidů BME/β-ME a dithiothreitol. V dalších částech podrobně rozebereme různé metody/redukční činidla.

Obrázek kreditu: Wikipedia

Metody redukce disulfidů

• Redukce disulfidu za použití TCEP.HCl (Tris (2-karboxyethyl) hydrochlorid).

Toto konkrétní redukční činidlo se široce používá v procesu redukce disulfidů různých proteinů (uvádí se, že jeho molekulová hmotnost je 286.64 g). Nejčastěji se používá jako sůl hydrochloridu. (TCEP.HCl). Má potenciál redukovat disulfidové vazby uvnitř i mezi proteiny. Je považován za skvělé redukční činidlo, protože je netěkavý (tak snadno se s ním pracuje) a bez zápachu.

Bylo pozorováno, že je rozpustný i stabilní ve většině vodných roztoků. Rozpustnost TCEP.HCl (hydrochloridová sůl) ve vodě je přibližně 310 g/l. Nejlepší na tom je, že díky své hydrofilní povaze je rozpustný v pufrech (vodných) při jakémkoli/téměř všech pH. Když mluvíme o jeho rozpustnosti v organickém rozpouštědle, je poměrně nízká (i v ethanolu, methanolu).

Výhodou použití TCEP je, že se před sulfhydrylreaktivní (zesíťovací) reakcí nemusí odstraňovat a selektivně (téměř úplně) redukuje stabilní alkyldisulfidy (rozpustné ve vodě) v širokém rozmezí pH. Efektivní pH pro redukci disulfidu je 1.5-9.0 a reakce probíhá za méně než 4-5 minut. (při teplotě místnosti).

Postup: 10 molárních ekvivalentů Tris (2-karboxyethyl) fosfinu je třeba za stálého míchání (při pokojové teplotě) přidat do pufru, který obsahuje oligonukleotidy. Po promíchání by měl být roztok neustále míchán po dobu alespoň deseti minut (při pokojové teplotě). Logikou je, že množství TCEP, které se použije při redukci, je úměrné snížení, což znamená, že více TCEP použitého rychleji bude redukce dokončena.

Důležitým bodem, který je třeba poznamenat při neutrálním pH, není zjištěno, že by TCEP byl stabilní ve fosfátových pufrech.

• Pomocí DTT (dithiothreitol)

Synonymem DTT je Clelandovo činidlo s molekulárním vzorcem C₄H₁₀O₂S₂. Je považován za standardní činidlo. Má to molární hmotnost 154.25 g/mol a vzhledem je to pevná látka (bílé barvy). Má bod tání 43 stupňů Celsia a vře při teplotě kolem 120-130 stupňů Celsia.

Jeho redoxní potenciál je kolem -0.33 V (při pH 7). Bylo pozorováno, že dithiothreitol je za normálních podmínek (vzhledem k atmosféře) nestabilní, a proto se oxiduje, proto by měl být skladován/uchováván v inertních plynech. Lepší bude chlazení (asi na 2-8 stupňů Celsia). Dithiothreitol se snadno rozpouští ve vodě a poskytuje čirý roztok. Je také rozpustný v etheru, alkoholu, jako je ethanol, chloroform atd.

Postup: Důležitým bodem, který je třeba poznamenat, je řešení DTT, které se používá v reakce by měla být připravena čerstvě v pořádku získat lepší výsledky a vyhnout se chybám. Molární zásobní roztok dithiothreitolu by měl být připraven ve vodě a přidán do tlumivého roztoku, který obsahuje protein (ten je třeba redukovat). Inkubace je nezbytná pro dosažení redukce, proto inkubace po dobu alespoň 25-30 minut při teplotě kolem 35 stupňů Celsia (vyšší než to bude také stačit, protože redukce je lepší při vyšší teplotě).

• Použití DTBA (dithiobutylaminu)

Dithiobutylamin se většinou používá jako sůl HCl. Je téměř bez zápachu, pevný (bílé barvy). Snadno se rozpouští ve vodě. Je také rozpustný v alkoholu, jako je methanol, ale nerozpouští se v chloroformu. Má chemický vzorec C₄H₁₁NS₂HCl a má molekulovou hmotnost 173.7.

Postup: DTBA se přidá do roztoku pufru obsahujícího protein, který má být redukován, při pH přibližně 7.0.

• Použití THPP (Tris (3-hydroxypropyl) fosfin)

Bylo zjištěno, že THPP je rozpustný ve vodě za všech podmínek a při všech vlastnostech. Je to látka bez zápachu. S touto chemikálií se docela snadno manipuluje, protože je poměrně stabilní a snadno nepodléhá oxidaci. Má potenciál snížit různé typy disulfidové vazby. Nejdůležitější je, že nezpůsobuje znečištění, což znamená, že spadá do kategorie zelené chemie.

Postup: Stejně jako ostatní metody zde je také THPP přidán do roztoku pufru obsahujícího požadovaný protein/látku s disulfidovou vazbou, která musí být redukována. Můžeme říci, že je to jedna z nejúčinnějších metod redukce disulfidů, protože je snadno ovladatelná, ekonomicky životaschopná a šetrná k životnímu prostředí.

Také čtení: