Různé typy PCR: Důležité koncepční MCQ

Obsah

Různé typy PCR

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je obecně klasifikován na základě nepatrných modifikací ve standardním procesu PCR. Různé typy PCR jsou následující:

Vnořená PCR

Tato technika je navržena ke snížení kontaminantů v amplifikované DNA z důvodu amplifikace náhodné vazby primeru. Vnořená PCR se provádí se dvěma různými sadami primerů ve dvou po sobě následujících cyklech PCR. Očekává se, že následující sada zesílí sekundární cíl uvnitř produktu primárního běhu. Tato technika je mimořádně úspěšná, i když vyžaduje mnohem více znalostí o zapojených sekvencích. 

Inverzní PCR

Provádí se, když je známa pouze jedna vnitřní sekvence templátové DNA. Tato technika je správná při identifikaci hraničních sekvencí k různým genovým inzertům. Tento proces zahrnuje sekvenci trávení a vlastní ligaci templátové DNA, což má za následek kousky DNA se známými sekvencemi na koncích neznámé sekvence.

Různé typy PCR
(Různé typy PCR): Reprezentace molekulární struktury Taq polymerázy https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1ktq_EBI.jpg

Reverzní transkripční PCR (RT-PCR)

Používá se k amplifikaci a identifikaci známých sekvencí z knihoven RNA. RNA získaná ze vzorku se potom převádí na komplementární DNA (cDNA) působením enzymové reverzní enzymové transkriptázy. Poté následovala typická PCR. RT-PCR se hojně používá při identifikaci a stanovení genové exprese.

Různé typy PCR
(Různé typy PCR): RT-PCR používá k detekci úrovní genové exprese fluorofory https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Beacons.jpg

Asymetrická PCR

Selektivně amplifikuje jedno vlákno templátové DNA více než druhé. Používá se při hybridizačním snímání, při kterém je za ideální považováno pouze jedno vlákno. Další amplifikace se dosáhne provedením standardní PCR v přítomnosti přebytečných primerů pro vybrané vlákno. 

Kvantitativní PCR (Q-PCR)

Toto je nepřímý postup měření počátečních množství RNA, cDNA nebo templátové DNA. Q-PCR se obecně používá k rychlému určení množství produktu PCR. Q-PCR se také používá k detekci specifických sekvencí uvnitř vzorku DNA.

Kvantitativní real-time PCR (QRT-PCR nebo RTQ-PCR)

Tento proces používá fluorescenční barviva ke sledování a měření množství amplifikovaných produktů v reálném čase. Tato kvantitativní PCR v reálném čase se používá v konjugaci s QPCR.

Touchdown PCR

Tato technika snižuje nespecifickou vazbu primeru snížením teploty nasedání mezi dvěma po sobě následujícími cykly PCR.

Kolonie PCR

Klony (např. E. coli) se analyzují na správné ligační produkty. Specifická kolonie se odebere přes sterilní párátko a zavede se do hlavní směsi. PCR se provádí s prodlouženou dobou při 95 ° CoC.

Alelově specifická PCR

Tato technika je založena na polymorfismu jednoho nukleotidu (SNP), alela-specifická PCR se často používá pro klonování a diagnostické účely. Jsou vyžadovány určité předchozí znalosti o DNA sekvenci alel a jejich rozdílech. Alelově specifická PCR zahrnuje použití primerů SNP obsahujících 3 'konec. Úspěšná alelově specifická amplifikace PCR a SNP specifické primery indikují přítomnost konkrétního SNP v sekvenci.

Sestava pro polymerázové cyklování (PCA) nebo sestava PCR

Zahrnuje umělou produkci dlouhých sekvencí DNA v přítomnosti dlouhých oligonukleotidů a krátkých překrývajících se segmentů podle standardního postupu PCR. Dlouhé oligonukleotidy se otáčejí v obou směrech (sense a anti-sense), překrývající se segment rozhoduje o pořadí fragmentů PCR, což usnadňuje selektivní produkci konečné dlouhé DNA.

Lineární následná exponenciální PCR (LATE-PCR)

V této technice má omezující primer (primer přítomný v nižším množství) vyšší teplotu tání než přebytek primeru (primer přítomný v dostatečném množství) pro udržení účinnosti reakce, protože koncentrace omezujícího primeru klesá uprostřed reakce . 

Dial-out PCR

Jedná se o způsob získávání molekul DNA pro syntézu genů. Knihovna DNA je před sekvenováním modifikována specifickými hraničními značkami. Později značené primery umožňují získání DNA požadovaných sekvencí pomocí PCR.

Zesílení závislé na helikáze

Souvisí to s tradiční PCR, ale místo cyklování používá konstantní teplotu. Místo kroku tepelné denaturace se používá DNA helikáza. 

Hot Start PCR

Tato technika propouští možnost nespecifické amplifikace během počátečních cyklů PCR. Reakční složky se zahřívají na denaturační teplotu 95oC před přidáním polymerázy. Pro inhibici se do reakční směsi zavádějí inhibitory a protilátky DNA polymeráza aktivita, která se disociuje při vysokých teplotách. 

Inter-sekvenčně specifická PCR

Tato modifikace techniky PCR se často používá pro otisky prstů DNA, což vyžaduje amplifikaci oblastí umístěných mezi opakování jednoduchých sekvencí, aby se vytvořil jedinečný a specifický otisk prstu / vzor amplifikovaných fragmentů DNA. 

Ligací zprostředkovaná PCR

Specificky využívá malé linkerové molekuly DNA (které mají být vloženy) a různé primery schopné hybridizace s linkerovou DNA. Tato technika je široce používána pro sekvenování DNA a footprint.

Methylačně specifická PCR

Tato technika se používá k detekci ostrovů CpG v genomu. V methylačně specifické PCR je DNA ošetřena hydrogensíranem sodným, který přeměňuje nemethylovanou cytosinovou bázi na uracil, který je identifikován / rozpoznán bázemi tyminu PCR primeru. Na změněné DNA se provádějí dvě různé sady PCR za použití identických sad primerů, s výjimkou CpG ostrovů primerů. Sady primerů rozpoznávají cytosinové báze a další sady primerů rozpoznávají uracil k amplifikaci nemetylované DNA. Q-PCR lze také provést za účelem znalosti kvantitativních informací týkajících se methylace. 

Koncepční MCQ na různých typech PCR (vyřešeno)

Otázka 1: Výzkumník se pokouší změnit pět po sobě jdoucích párů bází uprostřed fragmentů DNA amplifikovaných pomocí PCR. Jaká technika je pro provedení takového experimentu nejvíce doporučena?

A- ligace DNA

B - Test posunu elektroforetické mobility (EMSA)

C-PCR mutageneze

D- Restrikční enzym trávení

Správná odpověď: Možnost C PCR mutageneze 

Vysvětlení:

Nejvíce doporučovanou technikou pro tento typ modifikací je PCR mutageneze. Může syntetizovat primery, které se nedokonale vážou v požadovaném místě mutageneze. Tyto primery nyní budou obsahovat novou sekvenci párů 5 bazí, která má být zavedena do nového řetězce DNA. Nejprve bude PCR amplifikovat fragment DNA obsahující mutantní sekvenci a upstream sekvence. Druhý cyklus PCR bude amplifikovat nový řetězec DNA obsahující mutantní sekvenci a také následné sekvence. A závěrečný cyklus PCR bude amplifikovat jeden fragment DNA ze dvou šablon pomocí původních primerů k amplifikaci řetězce DNA v plné délce.

Otázka 2: Polymerázová řetězová reakce (PCR) využívá k amplifikaci řetězce DNA tepelně stabilní polymerázu (Taq polymerázu). Které z tvrzení nejlépe popisuje, proč jsou pro PCR vyžadovány tepelně stabilní polymerázy?

A-PCR vyžaduje tepelné cyklování a polymery Taq mohou být inaktivovány, protože nejsou nutné během nízkoteplotních kroků. 

B - Tepelně stabilní (Taq) polymeráza nerozbíjí dsDNA, pokud není teplota velmi vysoká. Proto je nutná tepelně stabilní (Taq) polymeráza.

C-PCR vyžaduje tepelné cyklování a tepelně stabilní (Taq) polymerázy nedenaturují, aby ztratily účinnost při polymeraci DNA během vysoké teploty (95oC) krok. 

D- Interakce mezi dvojmocnými kationty a DNA polymerázou je během vysokých teplot velmi účinná. Proto PCR vyžaduje tepelně stabilní DNA polymerázu.

E - Tepelně stabilní (Taq) polymerázy jsou levnější než standardní polymerázy; jsou tedy vhodnější pro amplifikaci DNA. 

Správná odpověď: Možnost C.

PCR vyžaduje tepelné cyklování a tepelně stabilní (Taq) polymerázy nedenaturují, aby ztratily účinnost při polymeraci DNA během vysoké teploty (95oC) krok. Díky tomu je jedinečný mezi různými typy PCR.

Vysvětlení:

Polymerázy často denaturují při vyšších teplotách. Pokud by byla použita standardní polymeráza, došlo by k její denaturaci během vysokoteplotního (denaturačního) kroku, který je nutný pro štěpení dvouvláknové DNA na templáty jednovláknové DNA. Použitím této tepelně stabilní (Taq) polymerázy se enzym nebude denaturovat. Řetězce DNA budou pokračovat v amplifikaci pomocí Taq polymerázy přidané na začátku PCR.

Otázka 3: Jaké je správné pořadí tří kroků PCR?

A- Prodloužení, denaturace, žíhání

B- Denaturace, žíhání, prodlužování 

C- Žíhání, prodlužování, denaturace

D- Denaturace, prodloužení, žíhání

Správná odpověď: Možnost B.

Denaturace, žíhání, prodlužování 

Vysvětlení:

Kroky PCR zahrnují denaturaci, žíhání a extenzi.

Denaturace se provádí při teplotě kolem 94-98 ° C, aby se rozbily vodíkové vazby dvouvláknové DNA. 

Žíhání je druhým krokem PCR dokončené při 50-65 ° C. Krok žíhání musí být proveden při nízké teplotě pro připojení primerů k jednomu řetězci, ale dostatečně vysoký, aby se zabránilo nespecifické hybridizaci. 

Krok prodloužení nebo prodloužení PCR umožňuje DNA polymeráze syntetizovat nejnovější kopii templátového řetězce DNA. Optimální teplota závisí na použité DNA polymeráze, ale obvykle se pohybuje v rozmezí 75-80 ° C.

Otázka 4: Která z následujících složek je / není složkou směsi polymerázové řetězové reakce?

A- Pufrovací roztok

B- DNA polymeráza

C- formamid

Řetězec šablony D- DNA

Správná odpověď: Možnost C.

Formamid

Vysvětlení:

Složkami PCR jsou DNA (Taq) polymeráza, pufr, primery, chlorid hořečnatý, dNTP (adenin, guanin, cytosin, thymin), deoxynukleotid trifosfáty a řetězec DNA templátu.

Závěry

V tomto článku jsme diskutovali o různých typech PCR. Další informace o tomto tématu naleznete na stránce různé typy PCR.

Pro více témat na biosyntéza a biotechnologie můžete navštívit naše stránky.

Také čtení: